Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
Перекрестный иммуноэлектрофорез представляет собой модификацию метода ИЭ и является подходящим как для качественного, так и для количественного анализа. Первая часть процедуры представляет собой обычный гель-электрофорез. По ее окончании протяженную полосу геля, содержащую разделенные фракции, подлежащие определению, вырезают и переносят на другую пластину. Электрофорез во втором направлении проводят перпендикулярно предыдущему электрофоретическому процессу в геле, содержащем относительно небольшую концентрацию антитела, соответствующего используемому антигену. Зависимость площади соответствующих пиков преципитации от количества соответствующего антигена является линейной для данной концентрации антитела и толщины геля.
Электроиммунный анализ, часто называемый ракетным
иммуноэлектрофорезом представляет собой быстрый метод количественного определения антигенов с зарядом, отличным от заряда антител, и наоборот.
Выполняют электрофорез антигена, подлежащего определению, в геле, содержащем относительно низкую концентрацию соответствующих антител. Испытуемый материал и разведения стандартного антигена, используемые для калибровки, вносят в разные лунки в геле. В процессе электрофореза появляются мигрирующие пикообразные зоны преципитации, начинающиеся от лунок. Фронт преципитации становится неподвижным, когда количество антигена перестает быть избыточным. Зависимость расстояния, пройденного фронтом преципитации, от количества нанесенного антигена является линейной для данной концентрации антител.
Обратный иммуноэлектрофорез представляет собой быстрый метод количественного определения, позволяющий устанавливать концентрационные градиенты внешних антител и антигенов в электрическом поле в зависимости от разницы зарядов. Разведения стандарта для калибровки и разведения испытуемого материала вносят в ряд лунок в геле, а в противоположный ряд лунок вносят фиксированное количество соответствующего реактанта. Титр испытуемого материала может быть определен как максимальное разведение, для которого наблюдается линия преципитации.
Существует ряд модификаций методов перекрестного иммуноэлектрофореза и электроиммунного анализа.
В других методах сочетается разделение антигенов по размеру молекул и серологическим свойствам.
Визуализация и характеризация линий иммунопреципитации.
Эти операции могут быть выполнены с использованием селективных или неселективных красителей, по флуоресценции, введением ферментных или изотопных меток или другими подходящими методами. Для характеризации в преципитатах веществ небелковой природы обычно используют методы селективного окрашивания.
В полупрозрачных гелях, например, на основе агара или агарозы, линии осаждения четко различимы визуально при условии наличия достаточной концентрации каждого из реактантов.
ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДА
Критерии валидации
Количественный иммунохимический метод является достоверным при выполнении следующих условий:
1. Антитела и антигены не имеют существенных отличий в стандартном и испытуемом образце. В случае меченых реактантов, различия меченого и немеченого компонента соответствующего реактанта должны быть незначительными.
2. На результат не должна оказывать влияния матрица, т.е. любой компонент испытуемого образца или используемые вспомогательные вещества, которые могут отличаться в разных образцах. В образцах могут содержаться высокие концентрации посторонних белков, солей, консервантов или веществ, обладающих протеолитической активностью.
3. Предел количественного определения должен быть ниже критерия, установленного в частной статье.
4. Точность определения должна быть достаточной для выполнения требований, предъявляемых в частных статьях.
5. Порядок, в котором проводится определение, не приводит к увеличению системных ошибок.
Методы валидации
Для проверки выполнения этих критериев разрабатывается процесс валидации, включающий следующие элементы:
1. Испытание выполняют не менее чем в трех повторностях.
2. Испытание проводят не менее чем для трех различных разведений препарата сравнения и трех разведений испытуемых препаратов, предполагаемая активность которых равна активности стандартного образца.
3. Используют рандомизированную схему количественного определения.
4. Если испытуемый препарат находится в сыворотке или в смеси с иными компонентами, стандарт должен быть приготовлен аналогичным образом.
5. Испытание должно включать измерение неспецифического связывания меченого реактанта.
6. В случае заместительного иммунного анализа:
а) определяют максимальное связывание (нулевое замещение),
б) разведения должны охватывать весь диапазон откликов от значений, близких к неспецифическому связыванию, до максимального связывания, предпочтительно, как для стандартного, так и для испытуемого препарата.
СТАТИСТИЧЕСКИЕ ВЫЧИСЛЕНИЯ
Кривые откликов, полученные для испытуемого и стандартного препаратов, могут быть проанализированы с использованием методов, описанных в разделе 5.3. Статистический анализ результатов биологических испытаний и количественных определений.
